Prodotti alimentari, agricoltura e biotecnologia

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Sistemi HCDC (High-Cell-Density Cultivation): approccio sperimentale e modellistico alla produzione di masse microbiche e di proteine eterologhe da lievito.

Descrizione: Nel campo della ricerca e dell’industria, il principale obiettivo delle fermentazioni è quello di massimizzare la produttività volumetrica. Le colture ad alta densità cellulare (HCDC) sono quelle che meglio rispondono a tale esigenza. Esistono diversi tipi di configurazione di fermentatore e diverse strategie di coltivazione per realizzare sistemi HCDC. In questa variegata tipologia, le culture fed-batch sono ampiamente usate perché permettono di massimizzare la massa microbica e la produttività attraverso il controllo della velocità di alimentazione del substrato al fermentatore. Nelle HCDC vengono utilizzati microrganismi procarioti o eucarioti, tra questi ultimi, il lievito Saccharomyces cerevisae è ancora l’unico ospite eucariote approvato per la produzione di biofarmaci dalla FDA e dall’EMEA. La ricerca condotta nel laboratorio di Microbiologia Industriale del DIIN è finalizzata ad ottimizzare i sistemi di coltivazione fed-batch attraverso lo studio del comportamento esibito dai ceppi di lievito prototrofi e auxotrofi soprattutto per quanto riguarda l’interazione tra parametri biologici (background genetico) e ambientali (condizioni di coltura e di processo). In particolare sono oggetto di investigazione parametri di processo che possono essere considerati potenziali fattori di stress, come il % di saturazione dell’aria, l’osmolarità e l’accumulo di sottoprodotti. In collaborazione con il gruppo di ricerca del Dip.to di Microbiologia, dell'Università di Valencia (Spagna), è stato sviluppato un efficiente sistema di secrezione di proteine eterologhe mediante ingegnerizzazione della parete del lievito S. cerevisiae costruendo fusioni geniche tra la proteina di interesse e la mannoproteina Pir4 della parete cellulare. Le proteine espresse in S. cerevisiae mediante questa originale strategia sono state: la xylanasi A da Bacillus sp. BP-7, l'interleuchina 1-beta e il fattore di crescita neuronale o NGF (Nerve Growth Factor), gli ultimi due di origine umana. Lo sviluppo di un modello matematico atto a definire l'idoneo profilo di alimentazione al fermentatore e a descrivere l’andamento delle variabili di processo è servito a simulare la produzione di l'interleuchina 1-beta nel caso di un lievito non convenzionale come Zygosaccharomyces bailii o quella di glucoamilasi (enzima impiegato nell’industria della saccarificazione) nel caso di un ospite non ben caratterizzato come Kluyveromyces lactis JA6/GAA. Il modello ha permesso, inoltre, di formulare nuove ipotesi sulla fisiologia di diversi ceppi auxotrofi del lievito convenzionale Saccharomyces cerevisiae, appartenenti alla famiglia Cen.Pk, esaminati nell’ambito di un progetto () avente come obiettivo la scelta dell’ospite più idoneo per l’espressione di proteine eterologhe. Infatti la modellazione ha evidenziato la diversa capacità respiratoria dei ceppi esaminati e le loro intrinseche debolezze, queste ultime correlate all’aliquota di substrato non utilizzata per produrre biomassa ma spesa per produrre energia per il mantenimento.

Ricercatori coinvolti: Palma Parascandola, Lucia Paciello, Carmine Landi

Immobilizzazione di enzimi e cellule microbiche

Descrizione: L’immobilizzazione di cellule microbiche è una tecnica che, confinando enzimi e cellule in/su un supporto insolubile, consente di impiegarle in sistemi continui ad elevate densità cellulari e a valori significativamente elevati di portata volumetrica, con conseguente aumento della produttività. Il gruppo di Microbiologia Industriale ha messo a punto una tecnica originale di immobilizzazione che consente l’intrappolamento di cellule del lievito Saccharomyces cerevisiae in un gel di gelatina in solubilizzata. Tali cellule conservano integra la loro funzionalità metabolica e sono in grado, quindi, di crescere in condizioni di immobilizzazione portando alla formazione di uno spesso e attivo biofilm sulla superficie del supporto. Le proprietà meccaniche dell’immobilizzato (resistenza alla compressione) sono superiori a quelle di altri immobilizzati ottenuti impiegando altri tipi di gel polimerici naturali come Ca-alginato e k-carrageenan e ne rendono possibile anche l’impiego in reattori continui a letto impaccato. Inoltre, tali cellule, a differenza di quelle cresciute in libera sospensione, mostrano una prolungata sintesi di invertasi e, più in generale, di enzimi repressi da glucosio. Lo studio dell’espressione del gene che codifica la sintesi dell’invertasi (SUC2) ha permesso di evidenziare che, nel sistema a cellule immobilizzate, i livelli di trascrizione di SUC2 rimangono significativamente elevati nel corso dell’intero arco di crescita. E’ presumibile che le limitazioni al trasporto di materia attraverso il supporto diano origine a condizioni microambientali tali da promuovere gli elevati livelli di espressione osservati e, quindi, la sintesi di invertasi. Tali risultati hanno permesso di utilizzare il sistema a cellule immobilizzate per la produzione in continuo di proteine eterologhe come l’enzima beta-glucoamilasi impiegato nella industria della saccarificazione dell’amido. Relativamente alla produzione di glucoamilasi, cellule del lievito non convenzionale K. lactis JA6GAA, sono state immobilizzate in Ca-alginato ed è stato allestito, in collaborazione con il gruppo di impianti del DIIN, un reattore a letto fluidizzato funzionante come un sistema bifasico (liquido-solido) o trifasico (gas–liquido–solido). La performance del sistema trifasico in termini di produttività specifica è risultata il doppio di quella del sistema bifasico data la possibilità di aumentare il tempo medio di residenza della fase liquida utilizzando quella gassosa per fluidizzare il letto.

Ricercatori coinvolti: Palma Parascandola, Lucia Paciello, Carmine Landi

Bio e chemiluminescenza come strumenti analitici nella determinazione della vitalità cellulare e di proteine di interesse per l’uomo

Descrizione: La scelta di un test di vitalità cellulare tra le tante opzioni disponibili può essere un compito impegnativo. Il migliore saggio di vitalità dovrebbe essere quello capace di soddisfare insieme le esigenze di rapidità e precisione che non sempre sono realizzabili contemporaneamente. Recentemente, il gruppo di Microbiologia Industriale ha determinato la vitalità di cellule provenienti da brodocolture di ceppi del lievito Saccharomyces cerevisiae, impiegando una tecnica basata sulla bioluminescenza cioè l'emissione di luce visibile da organismi viventi. A questo scopo, è stato utilizzato il sistema luciferina-luciferasi di Photinus pyralis (la lucciola). Il sistema luciferina-luciferasi della lucciola è stato adattato e standardizzato studiando la vitalità delle cellule di lievito in condizioni di crescita esponenziale. E’ stata presa in considerazione anche la vitalità delle cellule di lievito dopo l'esposizione ad alte temperature. Le potenzialità del sistema luciferina-luciferasi della lucciola sono state evidenziate sia nel rilevamento della crescita bilanciata durante prove in beuta che nella definizione di sotto-popolazioni di lievito in un sistema molto complesso come il fed-batch. Attualmente sono in corso prove per mettere a punto un saggio di chemiluminescenza, alternativo rispetto ad altre metodiche, che serva per la determinazione rapida di proteine di interesse, prodotte nel corso di processi fermentativi.

Ricercatori coinvolti: Palma Parascandola, Lucia Paciello, Carmine Landi

Estrazione e frazionamento di antiossidanti e nutraceutici mediante tecnologie supercritiche innovative.

Descrizione: Il nostro gruppo di ricerca lavora sull’Estrazione con Fluidi Supercritici (SFE) a partire dagli inizi degli anni ’80. L’estrazione diretta con fluidi supercritici da matrici vegetali potrebbe non essere efficace poiché molti composti indesiderati sono co-estratti a tutte le condizioni operative. Perciò, abbiamo lavorato su un nuovo schema di processo basato sulla separazione frazionata di estratti vegetali in due o più separatori operanti in serie. Tale configurazione di processo è estremamente efficace, specie per isolare gli oli essenziali dalle cere cuticolari, gli acidi grassi e i coloranti naturali, sfruttando le loro diverse solubilità. Ogni categoria di composti vegetali (foglie, fiori, semi) ha una diversa struttura ed il processo deve essere adattato ed ottimizzato per considerare le diverse resistenze al trasferimento di materia. Dal punto di vista delle applicazioni, gli estratti ottenuti possono essere classificati come: oli essenziali (per es. basilico e rosa), oli di semi (per es. mandorle), farmaci (per es. artemisinina da Artemisia Annua), biopesticidi (per es. piretrine dai fiori di piretro), nutraceutici (per es. astaxantina da lieviti rossi). L’Estrazione per Antisolvente Supercritico è una tecnologia innovativa anch’essa sviluppata di recente dal nostro gruppo di ricerca per il frazionamento di uno o più composti solidi da miscele liquide ed il loro recupero come solido secco. Esso consiste nel continuo flussare di CO2-SC e di una miscela liquida in un precipitatore pressurizzato. Se le condizioni di processo sono state opportunamente selezionate, il liquido è disciolto rapidamente nel fluido supercritico, mentre il solido precipita sul fondo del precipitatore e il solvente liquido è raccolto nel separatore a valle del precipitatore, in cui la miscela supercritica viene depressurizzata. Si ha un frazionamento dei composti e se il composto fosse ancora disciolto nella miscela supercritica, può essere recuperato nel separatore. Con questa tecnologia si possono efficacemente frazionare nutraceutici, antiossidanti o biopesticidi come materia secca da estratti etanolici. Sono stati efficacemente processati diversi estratti vegetali, come la polpa di chicchi di caffè, la buccia e i semi di uva, foglie di olivo, diverse piante e altre matrici vegetali. Il frazionamento di liquidi con fluidi supercritici (SFF) in una torre impaccata in controcorrente è un modo efficace per la purificazione o separazione di diverse miscele liquide; l’utilizzo di piccole unità in continuo rende questa tecnologia molto promettente per diversi processi industriali. Infatti, modulando i parametri di processo è possibile modificare la solubilità della fase fluida e di ottenere un frazionamento molto selettivo delle miscele liquide. Esempi di frazionamento con fluidi supercritici è l’eliminazione dell’esano dagli oli di semi o la rigenerazione degli oli fritti. In particolare, lo studio della purificazione dell’olio di arachidi fritto con il frazionamento continuo con CO2-SC in una colonna impaccata ha mostrato che la composizione di una corrente di testa purificata è molto simile all’olio fresco. Un’applicazione recente molto interessante di questo processo è il frazionamento di omega 3 a partire da olio di pesce, per concentrare EPA (acido eicosapentanoico) e DHA (acido docaesanoico). È possibile ottenere un prodotto finale con una concentrazione di EPA+DHA pari al 60% per applicazioni nutraceutiche e pari al 90% per utilizzi farmaceutici. Per migliorare il processo di frazionamento, è stata usata una colonna impaccata dell'altezza di 2.7 m.

Ricercatori coinvolti: Ernesto Reverchon, Giovanna Della Porta, Libero Sesti Osseo, Renata Adami, Mariarosa Scognamiglio, Roberta Campardelli

Componenti

PARASCANDOLA PalmaResponsabile
REVERCHON ErnestoResponsabile
SESTI OSSEO LiberoMembro

Laboratori

Laboratori Fluidi SupercriticiSCFs Labs

Allegati

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